Técnica de Willis

OBJETIVO: Aprender a realizar diferente métodos para la identificación y estudio de los parásitos en este caso la búsqueda de huevos y quistes.

FUNDAMENTO: Willis en 1921, describe este método basado en la propiedad que tienen las soluciones de densidad mayor de hacer flotar objetos menos densos. Este método está recomendado específicamente para la investigación de protozoarios y helmintos, consiste en la preparar la materia fecal con solución saturada de cloruro de sodio.

Es un método de concentración por flotación simple. Consiste en preparar el material fecal con Solución saturada de ClNa.

Utilidad:

Recomendado especialmente para la investigación de geohelmintos.
Los Huevos de helmintos de peso específico menor que la solución saturada de NaCl tienden a subir y adherirse a una lámina colocada en contacto con la superficie del líquido.
Este método es de alta sensibilidad en el diagnóstico de huevos livianos de helmintos: A. duodenale, N. americanus, A. lumbricoides, H. nana.
Limitaciones
los huevos y quistes de peso específico menor que la solución saturada de cloruro de sodio tienden a adherirse a un cubreobjetos colocado

MATERIAL:

·         Vaso de precipitado

·         Embudo

·         Tubo de ensaye

·         Portaobjetos

·         Cubreobjetos

·         abate lenguas

REACTIVOS

·         Sol. Saturada de NaCl

·         Sol. De yodo lugol

PROCEDIMIENTO:

1.- Tomar aproximadamente1gr de heces fecales con un abate lenguas.

2.- Colocar la muestra en un vaso de precipitado y mezclar con 10ml de solución saturada de cloruro de sodio.

3.-En un tubo de ensaye filtre la mezclar con una gasa, llenando completamente el tubo.

4.-Coloque un portaobjetos sobre el tubo de manera que el líquido haga contacto con el portaobjetos.

5.-Esperamos de 5 a 10 minutos.

6.-Los quistes o huevos flotaran y quedaran adheridos a la cara del portaobjetos que está en contacto con la mezcla.

7.-Colocar una gota de yodo lugol en el porta objetos y colocar el cubreobjetos.

8.-Examinar la muestra al microscopio con el objetivo 40x, buscamos quistes o huevecillos de parásitos.

9.-Reportar los resultados   

OBSERVACIONES

En esta práctica realizamos dos muestras diferentes, en la primera no encontramos nada interesante solo logramos ver restos de alimentos y en la segunda un campo de quistes en especial de Entamoeba histolytica.

Práctica 4: Técnica de Ritchie

Fundamento
Se basa en la concentración de los quistes y huevos por sedimentación mediante la centrifugación, con la ayuda de formol y éter para separar y visualizar los elementos parasitarios.
Unas ventajas que tiene ése método es concentrar y no deformar las formas parasitarias, permite el transporte y almacenamiento de la materia fecal procesada antes de ser examinada, se usa cuando se necesita una técnica para la evaluación de tratamiento y determinación de frecuencia.

Material y equipo
Centrifuga
Tubos de ensaye cónicos de 15 ml
Gasa cortada en cuadros
Embudos de polietileno
Vasos de precipitado de 5 ml
Aplicadores de madera
Pipetas Pasteur con bulbo
Portaobjetos de 26 x 76 mm
Cubreobjetos de 22 x 22 mm
Microscopio

Solución salina isotónica
Solución de formaldehido al 10%
Éter

Método
a) Con el aplicador de madera se coloca aproximadamente 1 gr. de la materia fecal en el vaso de precipitados, se añaden 10 ml de solución salina y se homogeniza

b) Se filtra la suspensión a través de la gasa colocada en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cónico

c) Se centrifuga la suspensión durante 2 minutos a 2000 rpm

d) Se decanta el sobrante y se resuspende el sedimento con solución salina, centrifugando, decantando y resuspendiendo 2 veces mas

e) Al último sedimento se agregan 10 ml de solución de formaldehído al 10% se mezcla y se deja reposar durante 10 minutos

f) Se añaden después 5 ml de éter, se tapan los tubos con tapones de caucho y se agitan enérgicamente durante 30 segundos.

g) Se centrifuga durante 2 minutos a 2000 rpm

h) Después de centrifugar se observan 4 capas:
* Éter e la superficial
*Un tapón de restos fecales
*Formaldehído
*Sedimento en el fondo del tubo, conteniendo los elementos parasitarios

i) Se decanta el sobrante

j) Se introduce la pipeta Pasteur hasta el sedimento, se extrae con cuidado una gota del sedimento y se coloca en un portaobjetos

k) Se le añade una gota de lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos se homogeniza, cubriéndolo con el mismo

l) Se observa la preparación en el microscopio con objetivos de 10X y 40X

Practica 3: Técnica de Faust - Bis

Mixquiahuala de Juárez Hgo. a 23 de septiembre del 2013.
Identifica Microorganismos Con Base En Técnicas Parasitólogas.
Practica No. 12
Método de concentración- Flotación de Faust.
Fundamento.
Este método se utiliza solución de Zn, cuya densidad especifica es de 1.180 (33%), que conforma un medio de densidad más alta que la de los huevos: Necator 1.055, Tricocéfalo 1.150, Ascaris fértil 1.110 y facilita que los huevos livianos de estos helmintos, con menor peso específico que la solución, se concentren y floten.
La concentración adecuada aconsejada es la que usa como reactivo una solución acuosa de sulfato Zn al 33% con una densidad al 1.180. El agua utilizada diluye y lava la materia fecal. El filtrado con gasa doblada y evita que los detritos gruesos traspasen las paredes, la centrifugación enriquece en la delgada película la superficie del líquido centrifugado con los huevos livianos de algunos helmintos.
Técnica.
Mezclar bien una porción de materia fecal para preparar una superficie de 10 partes de agua destilada.
Filtrar la suspensión a través de un gasa doblada en cuatro, sobre un tubo de centrifuga, ayudándose con  un embudo pequeño.
Centrifugar el filtrado a 2500 rpm por 1 min.
Decantar el líquido sobrenadante y completar con agua hasta igualar la medida anterior, centrifugar nuevamente. Resuspender el sedimento.
Repetir el procedimiento 2 veces hasta que el líquido sobrenadante esté listo.
Decantar nuevamente el líquido sobrenadante reemplazándolo por igual cantidad de solución de sulfato de Zn al 33%. Mezclar bien la solución con el sedimento. Centrifugar durante 1 minuto a 1500 rpm.
Tomar de 3-4 gotas de las partículas que flotan en la superficie del líquido. Colocarlos en un porta objeto y mezclarla con 1-2 gotas de lugol, colocar cubre objeto.
Examinar al microscopio y reporte sus resultados.

Conclusiones:
En las muestras de hoy no encontramos nada en especial, solo fibras vegetales y partículas de almidón

Practica 2: Técnica de Faust Equipo 1

Mixquiahuala de Juárez Hgo. a 19 de septiembre del 2013.
Identifica Microorganismos Con Base En Técnicas Parasitólogas.
Practica No. 12
Método de concentración- Flotación de Faust.
Fundamento.
Este método se utiliza solución de Zn, cuya densidad especifica es de 1.180 (33%), que conforma un medio de densidad más alta que la de los huevos: Necator 1.055, Tricocéfalo 1.150, Ascaris fértil 1.110 y facilita que los huevos livianos de estos helmintos, con menor peso específico que la solución, se concentren y floten.
La concentración adecuada aconsejada es la que usa como reactivo una solución acuosa de sulfato Zn al 33% con una densidad al 1.180. El agua utilizada diluye y lava la materia fecal. El filtrado con gasa doblada y evita que los detritos gruesos traspasen las paredes, la centrifugación enriquece en la delgada película la superficie del líquido centrifugado con los huevos livianos de algunos helmintos.
Técnica.
Mezclar bien una porción de materia fecal para preparar una superficie de 10 partes de agua destilada.
Filtrar la suspensión a través de un gasa doblada en cuatro, sobre un tubo de centrifuga, ayudándose con  un embudo pequeño.
Centrifugar el filtrado a 2500 rpm por 1 min.
Decantar el líquido sobrenadante y completar con agua hasta igualar la medida anterior, centrifugar nuevamente. Resuspender el sedimento.
Repetir el procedimiento 2 veces hasta que el líquido sobrenadante esté listo.
Decantar nuevamente el líquido sobrenadante reemplazándolo por igual cantidad de solución de sulfato de Zn al 33%. Mezclar bien la solución con el sedimento. Centrifugar durante 1 minuto a 1500 rpm.
Tomar de 3-4 gotas de las partículas que flotan en la superficie del líquido. Colocarlos en un porta objeto y mezclarla con 1-2 gotas de lugol, colocar cubre objeto.
Examinar al microscopio y reporte sus resultados.

Conclusiones:
En el método de Faust los resultados se ven mucho mas nítidos y claros. También en nuestra primera muestra fuimos capaces de encontrar quistes. En las otras dos solo se encontraron fibras

Practica No.1: Cropoparasitoscópico en fresco

Introducción: Como sabemos uno de los primeros microscopistas fue Antón Van Leewenk y a mediados del siglo XVII fue el primero en utilizar este método al observar directamente en sus propias heces fecales, trofozoitos de Giardia lamblia.                                                                                                      El método que necesitas es menos equipo y el más sencillo de realizar, corresponde a las preparaciones húmedas, que se hacen directamente con muestras de heces. Para las preparaciones directas de heces frescas o no preservadas, el formol sirve de diluyente.

Las preparacio0nes no teñidas son de especial valor para el estudio de parásitos vivos, como trofozoitos de protozoarios móviles, huevos helmitos y larvas de nematodos . El lugol se emplea principalmente para la búsqueda e identificación de quistes y larvas, con base a sus características. La mezcla normal en el tracto intestinal por lo general no asegura  una distribución uniforme de trofozoitos de protozoarios móviles, huevos de helmitos y larvas nematodos.

Sin embargo el examen de materia fecal directo o en fresco puede revelar o no parásitos, dependiendo de la intensidad de la infección.

Fundamento:

La solución salina isotónica de las condiciones adecuadas para que las células se mantengan viva. El medio ideal para todo tipo de parasito que puede encontrarse en las muestras de heces, en cualquier etapa de su desarrollo es la solución salina fisiológica, y el lugol en la práctica ha demostrado su eficacia para la tinción e identificación de parásitos intestinales.

Tipo de Muestra:

-2 Muestras de heces fecales.

Material:

4 Aplicadores de madera.

4 Portaobjetos de 25x76 mm

4 Cubreobjetos.

Reactivos

Solución salina isotónica

Lugol parasitológico.

Equipo:

2 Microscopios.

Técnica. (La técnica se debe repetir por cada muestra tenida).

1.       En un portaobjetos coloca una gota de solución salina isotónica.

2.       Con la punta del aplicador toma una pequeña muestra de aprox. de 1 a 4 mg de heces, en muestras con moco y sangre elegir esta parte para estudiar.

3.       Mezclar procurando hacer una suspensión en preparación delgada y no un frotis.

4.       Quitar de la suspensión fibras y otros fragmentos grandes.

5.       Colocar el cubreobjetos lentamente procurando no dejar burbujas.

6.       Examinar al microscópico en forma sistemática a seco débil y a seco fuerte.

7.       Repetir la operación con una gota de lugol en lugar de la solución salina.

Reporte.

En la primera muestra, que se mezcló con solución salina, se observó fibra normal y fibra vegetal. Lo importante se observó un  quiste del parasito. En la segunda muestra, que se mezcló con yodo lugol, el frotis fue mucho más espeso, pudimos observar fibra normal y fibra vegetal, además de observar restos de grasa.

Conclusión.

Esta práctica nos sirvió para poder empezar a identificar lo que contienen las muestras de heces fecales  así como descartar la posible presencia de quistes o  trofozoitos de un parasito, como el parásito que provoca la amibiasis (Emtamoeba histolytica).

 

Practicas de los agares

Materiales:

• Matraz Erlenmeyer
• Mechero Bunsen
• Tripie
• Tela de asbesto
• Agitador de vidrio
• Balanza granataria
• Vidrio de reloj
• Probeta
• Gasa
• Papel estraza
• Olla express

Agar McConkey:

Se tara el vidrio de reloj en la balanza. Se diluyen 1.5 gramos de agar en 30 ml de agua destilada.
Se vacía el agua al matraz Erlenmeyer y poco a poco se agrega el agar y se mueve con el agitador.
Una vez mezclado, se coloca el matraz en el tripie con la tela de asbesto y se calienta con el mechero.
Se deja 1 minuto hasta que el agar espume, se tapa con la gasa y se pone una tapa de papel estraza con nombre para identificar.
El matraz se mete a la olla express. Debe estar durante 10 min cuidando que no pase el rango de 15.Cuando haya pasado el tiempo necesario, los matraces se sacan y el agar se vacía en una caja petri. Se deja gelar y despues se siembra.

Agar E.M.B:

Se tara el vidrio de reloj en la balanza. Se diluyen 1.08 gramos de agar E.M.B en 30 ml de agua destilada.
Se vacía el agua al matraz Erlenmeyer y poco a poco se agrega el agar y se mueve con el agitador.
Una vez mezclado, se coloca el matraz en el tripie con la tela de asbesto y se calienta con el mechero.
Se deja 1 minuto hasta que el agar espume, se tapa con la gasa y se pone una tapa de papel estraza con nombre para identificar.
El matraz se mete a la olla express. Debe estar durante 10 min cuidando que no pase el rango de 15.Cuando haya pasado el tiempo necesario, los matraces se sacan y el agar se vacía en una caja petri. Se deja gelar y despues se siembra.

Practicas de Laboratorio

Practica 2: